Anti HCV activity and expression inhibition of HCC markers by protein extract from Iberis gibraltarica / Atividade anti-HCV e inibição da expressão de marcadores HCC por extrato de proteína de Iberis gibraltarica

Hepatitis C virus infection (HCV) is the foremost reason of progressive hepatic fibrosis and cirrhosis, with an elevated risk of hepatocellular carcinoma (HCC) development. Medicinal plants have been used for human health benefits for several years, but their therapeutic potential needs to be explored. The main objective of this study was to figure out the in vitro antiviral and anticancer characteristics of total crude protein of Iberis gibraltarica against HCV and HCC. Total crude protein of Iberis gibraltarica was isolated and quantified. The level of cytotoxicity was measured against the HepG2 cell line and it shows no significant cytotoxicity at the concentration of 504µg/ml. The anti-HCV effect was determined by absolute quantification via real time RT-PCR method and viral titer was reduced up to 66% in a dose dependent manner against the total protein of Iberis gibraltarica. The anticancer potential of Iberis gibraltarica was also examined through mRNA expression studies of AFP and GPC3 genes against the total protein of Iberis gibraltarica-treated HepG2 cells. The results show up to 90% of the down-regulation expression of AFP and GPC3. The obtained results indicate the therapeutic potential of total protein of Iberis gibraltarica against HCV and hepatocellular carcinoma in vitro.

A infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é a principal causa de fibrose hepática progressiva e cirrose, com risco elevado de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular (HCC). As plantas medicinais vêm sendo utilizadas para benefícios à saúde humana há vários anos, mas seu potencial terapêutico precisa ser explorado. O principal objetivo deste estudo foi descobrir as características antivirais e anticancerígenas in vitro da proteína bruta total de Iberis gibraltarica contra HCV e HCC. A proteína bruta total de Iberis gibraltarica foi isolada e quantificada. O nível de citotoxicidade foi medido contra a linha celular HepG2 e não apresenta citotoxicidade significativa na concentração de 504µg/ml. O efeito anti-HCV foi determinado por quantificação absoluta através do método RT-PCR em tempo real e o título viral foi reduzido em até 66% de forma dose-dependente contra a proteína total de Iberis gibraltarica. O potencial anticancerígeno de Iberis gibraltarica também foi examinado através de estudos de expressão de mRNA dos genes AFP e GPC3 contra a proteína total de células HepG2 tratadas com Iberis gibraltarica. Os resultados mostram até 90% da expressão de regulação negativa de AFP e GPC3. Os resultados obtidos indicam o potencial terapêutico da proteína total de Iberis gibraltarica contra HCV e carcinoma hepatocelular in vitro.

Prevalência de Influenza A, vírus sincicial respiratório eSARS-CoV-2 em pacientes com síndrome respiratóriaaguda grave em Passo Fundo, Rio Grande do Sul / Prevalence of Influenza A, respiratory syncytial virus andSARS-CoV-2 in patients with severe acute respiratorysyndrome in Passo Fundo, Rio Grande do Sul

A síndrome respiratória aguda grave (SRAG) é caracterizada por sintomas de febre alta, tosse e dispneia, e, na maioria dos casos, relacionada a uma quantidade reduzida de agentes infecciosos. O objetivo foi avaliar a prevalência dos vírus respiratórios Influenza A (FluA), vírus sincicial respiratório (RSV) e do novo coronavírus (SARS-CoV-2) em pacientes com internação hospitalar por SRAG. Estudo transversal, com pacientes em internação hospitalar com SRAG entre novembro de 2021 e maio de 2022. Dados sociodemográficos e clínicos e amostras da nasofaringe foram coletados/as, as quais foram submetidas à extração de RNA e testadas quanto à positividade para Influenza A, RSV e SARS-CoV-2 por meio da técnica de PCR em tempo real pelo método SYBR Green. Foram incluídos 42 pacientes, sendo 59,5% do sexo feminino, 57,1% idosos, 54,8% com ensino fundamental. A maior parte dos pacientes reportou hábito tabagista prévio ou atual (54,8%), não etilista (73,8%) e 83,3% deles apresentavam alguma comorbidade, sendo hipertensão arterial sistêmica e diabetes mellitus tipo 2 as mais prevalentes. Um total de 10,5% dos pacientes testou positivo para FluA, nenhuma amostra positiva para RSV e 76,3% positivos para SARS-CoV-2. Na população estudada, SRAG com agravo hospitalar foi observado em maior proporção, em mulheres, idosos e pessoas com comorbidades, embora sem significância estatística, sendo o novo coronavírus o agente etiológico mais relacionado, o que evidencia a patogenicidade desse agente e suas consequências ainda são evidentes após quase 2 anos de período pandêmico.

Severe acute respiratory syndrome (SARS) is characterized by symptoms of high fever, cough and dyspnea, and is in most cases related to a reduced amount of infectious agents. The objective was to assess the prevalence of respiratory viruses Influenza A (FluA), respiratory syncytial virus (RSV) and the new coronavirus (SARS-CoV-2) in patients hospitalized for SARS. Cross-sectional study, with patients hospitalized with SARS between November 2021 and May 2022. Sociodemographic and clinical data and nasopharyngeal samples were collected, which were subjected to RNA extraction and tested for positivity for Influenza A, RSV and SARS-CoV-2 using the real-time PCR technique using the SYBR Green method. 42 patients were included, 59.5% female, 57.1% elderly, 54.8% with primary education. Most patients reported previous or current smoking habits (54.8%), non-drinkers (73.8) and 83.3% of them had some comorbidity, with systemic arterial hypertension and type 2 diabetes mellitus being the most prevalent. A total of 10.5% of patients tested positive for FluA, no samples positive for RSV, and 76.3% positive for SARS-CoV-2. In the studied population, SARS with hospital injury was observed more frequently in women and the elderly, with associated comorbidities, with the new coronavirus being the most related etiological agent, which shows, although not statistically significant, that the pathogenicity of this agent and its consequences are still evident after almost 2 years of period pandemic.

Estudio del desempeño de dos métodos de detección de antígenos rápidos en hisopados combinados y en hisopados nasofaríngeos para la detección de SARS-CoV-2 / Performance study of two rapid antigen detection methods in combined swabs and nasopharyngeal swabs for detection of SARS-CoV-2

Resumen Se realizó una comparación del desempeño de los métodos rápidos de detección de antígenos para el diagnóstico de SARS-CoV-2 Veritor System de Becton Dickinson y Panbio de Abbott versus una reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción en tiempo real (RT-PCR) de Roche en un triage de demanda espontánea de pacientes febriles de un hospital público, para la detección de COVID-19. Se procesaron 36 hisopados de pacientes sospechosos por los tres métodos. La concordancia entre ambos métodos con la RT-PCR fue del 97%. La sensibilidad de los métodos de detección de antígenos versus la RT-PCR fue del 83% y la especificidad fue del 100%. El valor predictivo positivo (VPP) fue del 100% y el valor predictivo negativo (VPN) fue del 97%. La muestra que resultó discordante presentó un ciclo umbral (Ct) de 29,8. El método para detección de antígenos tuvo un desempeño aceptable, incluso con resultados de sensibilidad mayores que los declarados por los fabricantes (84% para el Veritor System y 93,3% para el Panbio).

Abstract A comparison of the performance of the rapid antigen detection methods for the diagnosis of SARS-CoV-2 Veritor System from Becton Dickinson and Panbio from Abbott versus a real-time polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR) Roche in a spontaneous demand triage of febrile patients of a public hospital was made, for the detection of COVID-19. Thirty six swabs from suspected patients were processed by the three methods. The concordance between both methods with RT-PCR real time was 97%. The sensitivity of the antigen detection methods versus RT-PCR real time was 83% and specificity was 100%. The positive predictive value (PPV) was 100% and the negative predictive value (NPV) was 97%. The sample that was discordant presented a threshold point (Ct) of 29.8. The method for antigen detection resulted in an acceptable performance, even with S results higher than those declared by the manufacturers (84% for the Veritor System and 93.3% for the Panbio).

Resumo Uma comparação do desempenho dos métodos rápidos de detecção de antígenos para o diagnóstico deSARS-CoV-2 Veritor System de Becton Dickinson e Panbio de Abbott versus uma reação em cadeia da polimerasecom transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) da Roche em uma triagem de demanda espontâneade pacientes febris de um hospital público, para a detecção de COVID-19. Foram processadas 36 amostrasde esfregaços de pacientes suspeitos pelos três métodos e a concordância entre os dois métodos com aRT-PCR foi de 97%. A sensibilidade dos métodos de detecção de antigenos versus a RT-PCR foi de 83% ea especificidade de 100%. O valor preditivo positivo (VPP) foi de 100% e o valor preditivo negativo (VPN)foi de 97%. A amostra que resultou discordante apresentou um ciclo limiar (Ct) de 29,8. O método paradetecção de antígenos teve um desempenho aceitável, mesmo com resultados de sensibilidade superioresaos declarados pelos fabricantes (84% para o Veritor System e 93,3% para o Panbio).

Optimized broad-range real-time PCR-based method for bacterial screening of platelet concentrates / Otimização de um método baseado em PCR em tempo real para rastreamento de bactérias em concentrados de plaquetas

Abstract Bacterial contamination of blood components remains a major challenge in transfusion medicine, particularly, platelet concentrates (PCs) due to the storage conditions that support bacterial proliferation. In this study, we develop a rapid, sensitive and specific real-time PCR protocol for bacterial screening of PCs. An internally controlled real-time PCR-based method was optimized and validated with our proprietary 16S Universal PCR Master Mix (IBMP/Fiocruz), which targets a conserved region of the bacterial 16S rRNA gene. Nonspecific background DNA was completely eliminated by treating the PCR Master Mix with ethidium monoazide (EMA). A lower limit of detection was observed for 10 genome equivalents with an observed Ct value of 34±1.07 in calibration curve generated with 10-fold serial dilutions of E. coli DNA. The turnaround time for processing, including microbial DNA purification, was approximately 4 hours. The developed method showed a high sensitivity with no non-specific amplification and a lower time-to-detection than traditional microbiological methods, demonstrating it to be an efficient means of screening pre-transfusion PCs.

Resumo A contaminação bacteriana dos componentes sanguíneos é um grande desafio na medicina transfusional, principalmente nos concentrados de plaquetas (PCs) devido às condições de armazenamento que favorecem a proliferação bacteriana. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo de PCR em tempo real rápido, sensível e específico para a triagem bacteriana de PCs. Um método baseado em PCR em tempo real, controlado internamente, foi otimizado e validado com um Master Mix Universal PCR 16S (IBMP / Fiocruz), que detecta uma região conservada do gene 16S rRNA bacteriano. O background de DNA não específico foi completamente eliminado tratando a PCR Master Mix com monoazida de etídio (EMA). O limite de detecção inferior observado foi de 10 cópias equivalentes do genoma com um valor de Ct 34 ± 1,07, a curva de calibração foi gerada com diluições seriada de 10 vezes do DNA de E. coli. O tempo de processamento, incluindo a purificação microbiana do DNA, foi de aproximadamente 4 horas. O método desenvolvido mostrou alta sensibilidade sem amplificação inespecífica e menor tempo de detecção do que os métodos microbiológicos tradicionais, demonstrando ser um meio eficiente de triagem de PCs pré-transfusionais.

PREX2 gene's expression in gastric antral epithelial cells of patients with H. pylori infection / Expressão do gene PREX2 em células epiteliais antrais gástricas em pacientes com infecção por H. pylori

ABSTRACT BACKGROUND: The Prex2 protein is a member of the Rac family proteins that belongs to small G proteins with a critical role in cell migration, cell proliferation, and apoptosis through its effects on PI3K cell signaling pathway and phosphatase activity of PTEN protein. The effect of PREX2 gene expression has been shown in some cancer cells. A survey of PREX2 gene expression in gastric antral epithelial cells of gastric cancer patients with Helicobacter pylori various genotypes infection can conduct to better understanding H. pylori infection's carcinogenesis. METHODS: In a case-control study, PREX2 gene expression was evaluated in gastric antral biopsy samples on four groups of patients referred to Sanandaj hospitals, including gastritis with (n=23) and without (n=27) H. pylori infection and gastric cancer with (n=21) and without (n=32) H. pylori infection. Each gastric biopsy sample's total RNA was extracted and cDNA synthesized by using Kits (Takara Company). The PREX2 gene expression was measured using the relative quantitative real-time RT-PCR method and ΔΔCt formula. RESULTS: The PREX2 gene expression increased in gastric antral biopsy samples of gastritis and gastric cancer patients with H. pylori infection (case groups) than patients without H. pylori infection (control groups) 2.38 and 2.27 times, respectively. The patients with H. pylori vacA s1m1 and sabB genotypes infection showed a significant increase of PREX2 gene expression in gastric cancer antral epithelial cells. CONCLUSION: H. pylori vacA s1m1 and sabB genotypes have the positive correlations with PREX2 gene expression in gastric antral epithelial cells of gastritis and gastric cancer patients.

RESUMO CONTEXTO: A proteína Prex2 é membro das proteínas da família Rac que pertencem a pequenas proteínas G com um papel crítico na migração celular, na proliferação celular e na apoptose através de seus efeitos na via de sinalização celular PI3K e atividade fosfatase da proteína PTEN. O efeito da expressão genética PREX2 tem sido mostrada em algumas células cancerosas. Um levantamento da expressão genética PREX2 em células epiteliais antrais gástricas de pacientes infectados com vários genótipos de Helicobacter pylori pode conduzir a um melhor entendimento da carcinogênese da infecção por H. pylori. MÉTODOS: Em estudo de caso-controle, a expressão genética PREX2 foi avaliada em amostras de biópsia antral gástrica em quatro grupos de pacientes encaminhados aos hospitais de Sanandaj, incluindo gastrite com (n=23) e sem (n=27) infecção por H. pylori e de câncer gástrico com (n=21) e sem (n=32) infecção por H. pylori. O RNA total de cada amostra de biópsia gástrica foi extraído e cDNA sintetizado por meio de kits (Takara Company). A expressão genética PREX2 foi medida utilizando-se o método RT-PCR em tempo real quantitativo relativo e a fórmula ΔΔCt. RESULTADOS: A expressão genética PREX2 aumentou em amostras de biópsia antral gástrica de pacientes com gastrite e câncer gástrico com infecção por H. pylori (grupos de casos) em relação aos sem infecção por H. pylori (grupos de controle) 2,38 e 2,27 vezes, respectivamente. Os pacientes com infecção por genótipos H. pylori vacA s1m1 e sabB apresentaram um aumento significativo da expressão genética PREX2 em células epiteliais antrais de câncer gástrico. CONCLUSÃO: Os genótipos H. pylori vacA s1m1 e sabB têm correlações positivas com a expressão genética PREX2 em células epiteliais antrais gástricas de pacientes com câncer gástrico e gastrites.

Molecular characterization of goose parvovirus in geese of Turkey / Caracterização molecular de parvovírus de ganso em gansos da Turquia

Goose parvovirus (GPV), also called Derzsy's disease, is a viral pathogen that causes high morbidity and mortality in goslings and ducklings. In this study, we perform the molecular characterization of the GPV in Turkey. The definition of similarity to the world of GPV isolates in Turkey and construction of a phylogenetic tree was aimed. For this purpose, the presence of GPV in the liver, spleen, and intestine tissues of nine goslings with symptoms such as dysphagia, bilateral ocular swelling, eye discharge, diarrhea, and fatigue were investigated by real-time PCR method and all samples were detected as positive. According to the data obtained by molecular characterization, phylogenetic analysis of GPV has been presented in Turkey. As a result of this study, it was determined that the GPVs available in Turkey are virulent strains.(AU)

O parvovírus do ganso (GPV), também chamado de doença de Derzsy, é um patógeno viral que causa alta morbidade e mortalidade em gansos e patinhos. Neste estudo, objetivou-se a determinação da caracterização molecular do GPV na Turquia, a definição da similaridade com o mundo dos isolados de GPV na Turquia e a construção de uma árvore filogenética. Para tanto, a presença de GPV no fígado, baço e tecidos do intestino de nove gansos com sintomas como disfagia, edema ocular bilateral, secreção ocular, diarreia e fadiga foram investigados pelo método de PCR em tempo real e todas as amostras foram detectadas tão positivo. À luz dos dados obtidos por caracterização molecular, a análise filogenética do GPV foi apresentada na Turquia. Como resultado deste estudo, foi determinado que os GPVs disponíveis na Turquia são cepas virulentas.(AU)

Evaluation of quantitative polymerase chain reaction for the detection of Toxoplasma gondii oocysts shed by cats / Avaliação da reação em cadeia da polimerase quantitativa para a detecção de oocistos de Toxoplasma gondii eliminados por gatos

Abstract Felines are definitive hosts of Toxoplasma gondii and can shed oocysts in their feces, contaminating the environment. Sporulated oocysts are highly resistant to the environment and have higher infectivity, which are attributed to many toxoplasmosis outbreaks. The aim of the present study was to evaluate a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) technique for the detection of T. gondii oocysts shed by cats. Twelve cats from a previous vaccine experiment were challenged orally with 600 cysts of the TgDoveBr8 strain on day 72. Fecal samples were collected daily using the centrifugal flotation technique, with microscopic examination (Sheather technique) and qPCR for 20 days after the challenge. Cats from all groups shed oocysts in their feces. Five negative cats in the Sheather were positive according to qPCR on the 3rd day post-inoculation (dpi). Oocysts were detected on the 4th dpi using the Sheather; however, there was no statistical difference between the two methods (p=0.1116). In addition, there was no statistically significant difference in oocyst shedding between the groups according to the Sheather technique (p=0.6534) and qPCR (p=0.9670). In conclusion, these results demonstrate that qPCR can be used as an alternative to the Sheather to detect and quantify T. gondii oocysts.

Resumo Felinos são hospedeiros definitivos do Toxoplasma gondii e podem eliminar oocistos nas fezes, contaminando o meio ambiente. Oocistos esporulados são altamente resistentes ao meio ambiente com elevada infectividade, sendo atribuído a muitos surtos de toxoplasmose. O objetivo do estudo foi avaliar a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para a detecção de oocistos de T. gondii eliminados por gatos. Doze gatos de um experimento prévio de vacina foram desafiados por via oral com 600 cistos da cepa TgDoveBr8 no dia 72. Amostras fecais foram coletadas diariamente pela técnica de centrifugo-flutuação seguida de exame microscópico (técnica de Sheather) e qPCR por 20 dias após desafio. Gatos de todos os grupos eliminam oocistos nas fezes. Cinco gatos negativos na técnica Sheather foram positivos de acordo com a qPCR no 3º dia pós-inoculação (dpi). Oocistos foram detectados no 4º dpi no Sheather; entretanto, não houve diferença estatística entre os dois métodos (p=0,1116). Não houve diferença estatisticamente significativa na eliminação de oocistos entre os grupos de acordo com a técnica de Sheather (p = 0,6534) e qPCR (p = 0,9670). Em conclusão, esses resultados demonstram que qPCR pode ser usada como uma alternativa ao Sheather para detectar e quantificar oocistos de T. gondii.

Molecular characterization of goose parvovirus in geese of Turkey

ABSTRACT: Goose parvovirus (GPV), also called Derzsys disease, is a viral pathogen that causes high morbidity and mortality in goslings and ducklings. In this study, we perform the molecular characterization of the GPV in Turkey. The definition of similarity to the world of GPV isolates in Turkey and construction of a phylogenetic tree was aimed. For this purpose, the presence of GPV in the liver, spleen, and intestine tissues of nine goslings with symptoms such as dysphagia, bilateral ocular swelling, eye discharge, diarrhea, and fatigue were investigated by real-time PCR method and all samples were detected as positive. According to the data obtained by molecular characterization, phylogenetic analysis of GPV has been presented in Turkey. As a result of this study, it was determined that the GPVs available in Turkey are virulent strains.

RESUMO: O parvovírus do ganso (GPV), também chamado de doença de Derzsy, é um patógeno viral que causa alta morbidade e mortalidade em gansos e patinhos. Neste estudo, objetivou-se a determinação da caracterização molecular do GPV na Turquia, a definição da similaridade com o mundo dos isolados de GPV na Turquia e a construção de uma árvore filogenética. Para tanto, a presença de GPV no fígado, baço e tecidos do intestino de nove gansos com sintomas como disfagia, edema ocular bilateral, secreção ocular, diarreia e fadiga foram investigados pelo método de PCR em tempo real e todas as amostras foram detectadas tão positivo. À luz dos dados obtidos por caracterização molecular, a análise filogenética do GPV foi apresentada na Turquia. Como resultado deste estudo, foi determinado que os GPVs disponíveis na Turquia são cepas virulentas.

Detection of the Brachyspina mutation in Uruguayan Holstein cows using real time PCR and melting curve analysis / Detecção da mutação da Brachyspina em vacas Holandês Uruguaias usando PCR em tempo real e análise da curva de fusão

ABSTRACT: Brachyspina syndrome (BS) is a rare monogenic autosomal recessive hereditary disorder of the Holstein Fresian breed caused by a deletion of 3.3Kb in the Fanconi anemia complementation group I (FANCI) gene on BTA-21, which leads to a frame-shift and premature stop codon. Some of the consequences of BS are the reduction of the fertility rate and milk production. This study developed a simple, sensitive, rapid cost- effective assay method based on real time PCR and melting curve analysis for the detection of BS carrier animals. Sixty-eight normal homozygous and four heterozygous carrier genotypes were detected and confirmed through traditional PCR- electrophoresis analysis. We concluded that the assay we have developed proved to be a reliable, highly precise and low-cost tool, which could be used to monitor the presence of the BS mutation in uruguayan Holstein breed.

RESUMO: A síndrome de Brachyspina (BS) é um defeito hereditário monogênico autossômico recessivo raro da raça Holstein Friesian causado por uma exclusão de 3,3 KB no gene FANCI localizado no cromossomo bovino 21, o que leva a um deslocamento de quadro e um códon de parada prematuro. Uma consequência da BS é a eficiência de reprodução reduzida e a produção de leite. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de um método simples, rápido e sensível, baseado em PCR em tempo real e análise da curva de fusão para identificar animais portadores de BS. Sessenta e oito genótipos homozigotos normais e quatro heterozigotos foram detectados e confirmados através da análise tradicional de PCR e electophorese. Concluímos que o novo método é uma ferramenta confiável, altamente precisa e de baixo custo, que poderia ser usado para monitorar a presença da mutação BS na raça Holandês uruguaia.

Factors associated with Leishmania infection in dogs and geospatial analysis in the Sertão of Paraíba, Northeast Brazil / Fatores associados à infecção por Leishmania em cães e análise espacial no Sertão da Paraíba, Nordeste do Brasil

Abstract Visceral leishmaniasis (VL) is a zoonosis with a worldwide distribution that has a major impact on public health. The aim of this study was to verify the prevalence of canine infection by Leishmania infantum, the factors associated with the infection and its spatial distribution in the municipality of Mãe D'Água, in the Sertão region of Paraíba State, Northeast Brazil. Blood samples were collected from 150 dogs for diagnosis by the DPP®, ELISA-S7®, ELISA-EIE® and qPCR assays. The prevalence was calculated considering the positivity in at least two tests. SaTScan® was used for spatial analysis. The prevalence of canine infection with Leishmania was 18.6% (28/150), with the rural area being identified as a risk factor (Odds Ratio (OR) = 2.93). The permanence of the dog loose during the night (OR = 0.33) and deworming (OR = 0.30) were identified as protective factors. A risk cluster was formed in the northern region of the urban area. Mãe D'Água showed a pattern of active transmission in the rural area, but VL control measures also need to be carried out in the urban area to prevent human cases and the spread of the disease in the risk zone.

Resumo A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose com distribuição mundial de grande impacto na saúde pública. O objetivo deste estudo foi verificar a prevalência da infecção canina por Leishmania infantum, os fatores associados à infecção e sua distribuição espacial no município de Mãe D'Água, na região do Sertão da Paraíba, Nordeste do Brasil. Amostras de sangue foram coletadas de 150 cães para diagnóstico pelos ensaios DPP®, ELISA-S7®, ELISA-EIE® e qPCR. A prevalência foi calculada considerando-se a positividade em pelo menos dois testes. O SaTScan® foi utilizado para a análise espacial. A prevalência da infecção canina com Leishmania foi de 18,6% (28/150), sendo a zona rural identificada como fator de risco (Odds Ratio (OR) = 2,93). A permanência do cão solto durante a noite (OR = 0,33) e a vermifugação (OR = 0,30) foram classificadas como fatores de proteção. Um cluster de risco foi formado na região Norte da área urbana. Mãe D'Água apresentou um padrão de transmissão ativa na área rural, porém medidas de controle da LVC também precisam ser realizadas na área urbana para evitar casos humanos e a dispersão da doença na zona de risco.

Diagnóstico laboratorial do SARS-CoV-2 por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) / Laboratory diagnosis of SARS-CoV-2 by real time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

O diagnóstico da COVID-19 está alicerçado na clínica do paciente, nos exames de imagem e no diagnóstico laboratorial. O exame de detecção do ácido nucleico viral por transcrição reversa (RT) seguido da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) foi rapidamente o primeiro método de diagnóstico laboratorial estabelecido e permanece como o padrão ouro. Esta narrativa descritiva é resultado de uma busca referenciada onde o ponto focal foi descrever o diagnóstico laboratorial do SARS-CoV-2 por RT-PCR. O diagnóstico laboratorial do SARS-CoV-2 por RT-PCR envolve as etapas de extração do RNA, transcrição reversa para obtenção do DNA complementar e a reação em cadeia da polimerase. A detecção da amplificação do material genético é realizada pela medida de fluorescência emitida. Entre as várias amostras biológicas que podem ser utilizadas, aquela que tem apresentado mais praticidade e precisão é a de swab da nasofaringe. A coleta da amostra deve ser, idealmente, realizada até sete dias a partir do início dos sintomas. Quando o SARS-CoV-2 é detectado na RT-PCR, o diagnóstico de COVID-19 é confirmado. No entanto, um único resultado de SARS-CoV-2 não detectado em paciente sintomático não exclui o diagnóstico. O exame não tem apresentado reações cruzadas com outros patógenos respiratórios. Contudo, o exame é caro e demorado, e pode resultar em falso negativo devido ao momento inadequado da coleta da amostra, coleta e manuseio impróprio de amostras e material genético viral insuficiente no sítio de coleta. Lacunas diagnósticas ainda permanecem na triagem de assintomáticos e na detecção de vírus vivos na convalescença.

The diagnosis of COVID-19 is based on the patient's clinic, imaging tests and laboratory diagnosis. The detection of viral nucleic acid by reverse transcription (RT) followed by real-time polymerase chain reaction (PCR) was quickly the first established laboratory diagnosis method and remains the gold standard. This descriptive narrative is a result of a referenced search where the focal point was to describe the laboratory diagnosis of SARS-CoV-2 by RT-PCR. The laboratory diagnosis of SARS-CoV-2 by RT-PCR involves the RNA extraction, reverse transcription to obtain complementary DNA, and the polymerase chain reaction steps. The detection of genetic material amplification is carried out by measuring the emitted fluorescence. Among the various biological samples that can be used, the one that has shown the most practicality and precision is the nasopharyngeal swab. Sample collection should be performed, ideally, within 7 days from the symptoms onset. When SARS-CoV-2 is detected by RTPCR, the diagnosis of COVID-19 is confirmed. However, a single result of undetected SARS-CoV-2 in a symptomatic patient does not exclude the diagnosis. The test has not shown cross-reactions with common respiratory pathogens. However, the test is costly and timeconsuming, a false-negative result may arise due to inadequate sample collection time, improper samples collection and handling, and insufficient viral genetic material at the collection site. Diagnostic gaps remain on asymptomatic patients screening, and in the detection of live viruses in convalescence.

Evolução da técnica de PCR: sua contribuição no diagnóstico da infecção por HPV / Evolution of techinique PCR: its contribution to infection diagnosis by HPV

Introdução: a reação em cadeia da polimerase (PCR) é a técnica de biologia molecular mais utilizada na detecção viral, principalmente em situações onde a quantidade de DNA disponível é pequena. O papilomavírus humano (HPV) representa um dos mais graves problemas de saúde pública e está associado ao câncer do colo do útero, especialmente em países em desenvolvimento, como o Brasil, que desde 2009 já apresentava 40 mil novos casos por ano. Objetivo: descrever a evolução da PCR e sua contribuição no diagnóstico do HPV. Metodologia: realizou-se uma revisão de literatura a partir de publicações disponíveis em base de dados eletrônicos, como Science Direct, SciELO, Pubmed, Instituto Nacional do Câncer e Ministério da Saúde do Brasil, nos últimos cinco anos. Resultados: dentre as técnicas citadas nesta revisão de literatura, todas têm alta relevância na detecção de genotipagem do HPV, embora a escolha quanto ao melhor desempenho fique a critério do pesquisador. A técnica de Nested PCR demonstra ser a mais vantajosa na detecção do vírus, pelo fato de ter uma maior sensibilidade, em comparação com as demais. Conclusão: a técnica PCR possui alta sensibilidade (90-100%) e apresenta 92,8 a 100% de especificidade, sendo padrão ouro para a detecção de DNA do HPV, em amostras citológicas do câncer de colo do útero. Assim, os dados obtidos permitem constatar que a técnica PCR, utilizada para o rastreamento do HPV, é considerada padrão ouro, tendo maior sensibilidade, especificidade e velocidade de análise, devendo ser o método de escolha para o diagnóstico eficiente do HPV.

Introduction: polymerase chain reaction (PCR) is the most widely used molecular biology technique for viral detection, especially in situations where the amount of available DNA is small. Human papillomavirus (HPV) represents one of the most serious public health problems and is associated with cervical cancer, especially in developing countries such as Brazil that has had 40,000 (forty thousand) new cases a year, since 2009. Objective: to describe the evolution of PCR and its contribution to HPV diagnosis. Methodology: a literature review was conducted from publications available in electronic databases, such as Science Direct, SciELO, Pubmed, National Cancer Institute and Ministry of Health of Brazil, in the last five years. Results: among the techniques cited in this literature review, all have high relevance in the detection of HPV genotyping, although the choice for the best performance is at the discretion of the researcher. The Nested PCR technique proves to be the most advantageous in detecting the virus because it has a higher sensitivity compared to the others. Conclusion: the PCR technique has high sensitivity (90-100%) and presents 92.8 to 100% specificity, being the gold standard for the HPV DNA detection in cytology samples of uterus cervix cancer. Thus, the data obtained show that the PCR technique used for HPV screening is considered the gold standard, having greater sensitivity, specificity and speed of analysis, and should be the method of choice for the efficient diagnosis of HPV.

The apoptotic, angiogenic and cell proliferation genes CD63, S100A6 e GNB2L1 are altered in patients with endometriosis / Os genes apoptóticos, angiogênicos e de proliferação celular CD63, S100A6 e GNB2L1 estão alterados em pacientes com endometriose

Abstract Objective The aim of the present study was to analyze the expression of the CD63, S100A6, and GNB2L1genes, which participate in mechanisms related to the complex pathophysiology of endometriosis. Methods A case-control study was conducted with 40 women who were diagnosed with endometriosis, and 15 fertile and healthy women. Paired samples of eutopic endometrium and endometriotic lesions (peritoneal and ovarian endometriotic implants) were obtained from the women with endometriosis in the proliferative (n = 20) or secretory phases (n = 20) of the menstrual cycle. As controls, paired endometrial biopsy samples were collected from the healthy women in the proliferative (n = 15) and secretory (n = 15) phases of the samemenstrual cycle.We analyzed the expression levels of the CD63, S100A6, and GNB2L1 genes by real-time polymerase chain reaction. Results An increase in CD63, S100A6, and GNB2L1 gene transcript levels was observed in the ectopic implants compared with the eutopic endometrium of the women with and without endometriosis, regardless of the phase of the menstrual cycle. Conclusion These findings suggest that the CD63, S100A6, and GNB2L1 genesmay be involved in the pathogenesis of endometriosis, since they participate in mechanisms such as inhibition of apoptosis, angiogenesis and cell proliferation, which lead to the loss of cell homeostasis in the ectopic endometrium, thus contributing to the implantation and survival of the tissue in the extrauterine environment.

Resumo Objetivo O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão dos genes CD63, S100A6 e GNB2L1, que participam em mecanismos relacionados à complexa fisiopatologia da endometriose. Métodos Um estudo caso-controle foi realizado com 40 mulheres diagnosticadas com endometriose e 15 mulheres férteis e saudáveis. Amostras pareadas de endométrio eutópico e de lesões endometrióticas (implantes endometrióticos peritoneais e ovarianos) foram obtidas de mulheres com endometriose nas fases proliferativa (n = 20) ou secretora (n = 20) do ciclo menstrual. Como controle, amostras pareadas de biópsia endometrial foram coletadas de mulheres saudáveis nas fases proliferativa (n = 15) e secretora (n = 15) nomesmo ciclomenstrual. Foram analisados os níveis de expressão dos genes CD63, S100A6 e GNB2L1 por reação em cadeia da polimerase em tempo real. Resultados Foi observado um aumento nos níveis de transcritos dos genes CD63, S100A6 e GNB2L1 em implantes ectópicos quando comparado ao endométrio eutópico de mulheres com e sem endometriose, independente da fase do ciclo menstrual. Conclusão Estes achados sugerem que os genes CD63, S100A6 e GNB2L1 podem estar envolvidos na patogênese da endometriose, pois participam de mecanismos como inibição de apoptose, angiogênese e proliferação celular, os quais levam à perda da homeostase celular no endométrio ectópico e, portanto, contribuem para o implante e a sobrevivência do tecido no ambiente extrauterino.

Real-time PCR for traceability and quantification of genetically modified seeds in lots of non-transgenic soybean / PCR em tempo real para rastreabilidade e quantificação de sementes geneticamente modificados em lotes de soja não transgênica

The constant presence of genetically modified (GM) soybean in conventional seed lots has become a growing problem for international seed trade. In this context, seed companies have prompted the development of routine tests for accurate genetically modified soybean seeds detection. In this study, a quantitative PCR-based method was standardized in order to detect and quantify mixtures of seeds (i.e. certified seed) or GM grains (i.e. seeds came from field) into samples of non-GM soybean, in a way that soybean lots can be assessed within the standards established by legislation. The method involved the use of p35S-f2/petu-r1 primers targeting CP-4 enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (cp4-epsps) gene (i.e. that confers herbicide tolerance in Roundup ReadyTM (RR)) for real-time PCR detection and quantification through mericon Quant GMO Detection Assay. The results revealed the method efficiency to detect and quantify the presence of even one soybean seed in batch used for routine evaluation of GM seeds. In addition, it was possible to detect of up to 0.1% of transgenic DNA relative to the soybean grains content. Thus, the sensitive GMO quantitative approach described in this study will provide support in supervising activities, and facilitate the process and control of GM soybean.

A constante presença da soja geneticamente modificada (GM) em lotes de sementes convencionais têm se tornado um grande problema para o comércio internacional de sementes. Neste contexto, as empresas de sementes estão em busca de testes de rotina extremamente precisos para a detecção de sementes de soja geneticamente modificadas. Neste estudo, um método baseado em PCR quantitativo foi padronizado para detectar e quantificar misturas de sementes (i.e. sementes certificadas) ou grãos geneticamente modificados (i.e. sementes oriundas do campo) dentro de lotes de soja não transgênica, de um modo que os lotes de soja possam ser avaliados dentro dos parâmetros estabelecidos pela legislação. O método envolveu o uso dos iniciadores p35S-f2/petu-r1 alvejando o gene CP-4 5-nolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintase (cp4-epsps) (i.e. que confere a tolerância ao herbicida Roundup Ready® (RR)) para detecção e quantificação em PCR de tempo real via Ensaio de detecção Mericon Quant GMO. Os resultados revelaram um método eficiente para detectar e quantificar a presença de até mesmo uma única semente de soja no lote usado para a avaliação de rotina de sementes geneticamente modificadas. Adicionalmente, foi possível detectar até 0,1% de DNA transgênico relativo ao conteúdo de grãos de soja. Dessa forma, uma abordagem quantitativa sensível à soja geneticamente modificada foi descrita nesse estudo e poderá fornecer suporte em atividades de supervisão, além de facilitar o processo de controle da soja geneticamente modificada.

Identificação laboratorial da coqueluche na região do oeste do Estado de São Paulo / Laboratory identification of pertussis in the western region of São Paulo, Brasil

O objetivo deste estudo foi de confirmar laboratorialmente os casos suspeitos de coqueluchena região oeste do Estado de São Paulo, ocorridos entre 2010 a 2015. A cultura foi realizadano Centro de Laboratório Regional - Instituto Adolfo Lutz de Presidente Prudente e a PCR emtempo real (qPCR) foi realizada no Centro de Referência Nacional para Pertussis – Instituto AdolfoLutz em São Paulo, SP. Foram recebidas 189 amostras, sendo 29 (15,3%) confirmadas segundoos critérios laboratoriais (cultura e/ou qPCR). A faixa etária mais acometida foi em criançasmenores de seis meses de idade (82,8%), não vacinados ou com o esquema de vacinação incompleto.Provavelmente, estes resultados representam apenas uma fração do número real de casos decoqueluche que ocorrem no Brasil. O contínuo monitoramento da doença e informações daprevalência por faixa etária são importantes ferramentas para melhorar as estratégias de imunizaçãocomo forma de controlar esta doença reemergente.

The aim of this study was to confirm the suspected cases of pertussis in the Western region ofthe Sao Paulo State from 2010 to 2015. The samples were cultured in the Instituto Adolfo Lutz -Regional Laboratory of Presidente Prudente-SP, and the qPCR was performed at the NationalReference Laboratory for Pertussis – Central Instituto Adolfo Lutz, São Paulo-SP. In this period,189 samples were received, being 29 (15.3%) confirmed by the laboratory criteria (culture and/orqPCR). The most affected group was the children less than six months old (82.8%), not vaccinatedor with the incomplete vaccination. Most likely, these results only represent a fraction of theactual number of pertussis cases occurring in Brazil. The continuous disease monitoring and theprevalence data by age group are fundamental to improve the immunization strategies as a way tocontrol this important re-emerging disease.

Identificação laboratorial da coqueluche na região do oeste do Estado de São Paulo / Laboratory identification of pertussis in the western region of São Paulo State, Brazil

O objetivo deste estudo foi de confirmar laboratorialmente os casos suspeitos de coqueluche na região oeste do Estado de São Paulo, ocorridos entre 2010 a 2015. A cultura foi realizada no Centro de Laboratório Regional - Instituto Adolfo Lutz de Presidente Prudente e a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada no Centro de Referência Nacional para Pertussis – Instituto Adolfo Lutz em São Paulo, SP. Foram recebidas 189 amostras, sendo 29 (15,3%) confirmadas segundo os critérios laboratoriais (cultura e/ou qPCR). A faixa etária mais acometida foi em crianças menores de seis meses de idade (82,8%), não vacinados ou com o esquema de vacinação incompleto. Provavelmente, estes resultados representam apenas uma fração do número real de casos de coqueluche que ocorrem no Brasil. O contínuo monitoramento da doença e informações da prevalência por faixa etária são importantes ferramentas para melhorar as estratégias de imunização como forma de controlar esta doença reemergente.

The aim of this study was to confirm the suspected cases of pertussis in the Western region of the Sao Paulo State from 2010 to 2015. The samples were cultured in the Instituto Adolfo Lutz - Regional Laboratory of Presidente Prudente-SP, and the qPCR was performed at the National Reference Laboratory for Pertussis – Central Instituto Adolfo Lutz, São Paulo-SP. In this period, 189 samples were received, being 29 (15.3%) confirmed by the laboratory criteria (culture and/or qPCR). The most affected group was the children less than six months old (82.8%), not vaccinated or with the incomplete vaccination. Most likely, these results only represent a fraction of the actual number of pertussis cases occurring in Brazil. The continuous disease monitoring and the prevalence data by age group are fundamental to improve the immunization strategies as a way to control this important re-emerging disease.

Nasal swab real-time PCR is not suitable for in vivo diagnosis of bovine tuberculosis / A PCR em tempo real de swab nasal não é adequada para o diagnóstico in vivo de tuberculose bovina

Bovine tuberculosis (bTB) is a zoonosis causing economic losses and public health risks in many countries. The disease diagnosis in live animals is performed by intradermal tuberculin test, which is based on delayed hypersensitivity reactions. As tuberculosis has complex immune response, this test has limitations in sensitivity and specificity. This study sought to test an alternative approach for in vivo diagnosis of bovine tuberculosis, based on real-time polymerase chain reaction (PCR). DNA samples, extracted from nasal swabs of live cows, were used for SYBR® Green real-time PCR, which is able to differentiate between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complexes. Statistical analysis was performed to compare the results of tuberculin test, the in vivo gold standard bTB diagnosis method, with real-time PCR, thereby determining the specificity and sensitivity of molecular method. Cervical comparative test (CCT) was performed in 238 animals, of which 193 had suitable DNA from nasal swabs for molecular analysis, as indicated by amplification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene, and were included in the study. In total, 25 (10.5%) of the animals were CCT reactive, of which none was positive in the molecular test. Of the 168 CCT negative animals, four were positive for M. tuberculosis complex at real time PCR from nasal swabs. The comparison of these results generated values of sensitivity and specificity of 0% and 97.6%, respectively; moreover, low coefficients of agreement and correlation (-0.029 and -0.049, respectively) between the results obtained with both tests were also observed. This study showed that real-time PCR from nasal swabs is not suitable for in vivo diagnosis of bovine tuberculosis; thus tuberculin skin test is still the best option for this purpose.(AU)

A tuberculose bovina (bTB) é uma zoonose que causa perdas econômicas e riscos à saúde pública em muitos países. O diagnóstico da doença em animais vivos é realizado pelo teste intradérmico da tuberculina, que é baseado em reações de hipersensibilidade tardia. Como a tuberculose tem resposta imunológica complexa, este teste tem limitações em termos de sensibilidade e especificidade. Este estudo procurou desenvolver uma abordagem alternativa para o diagnóstico in vivo da tuberculose bovina, com base na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. As amostras de DNA, extraídas de suabes nasais de vacas vivas, foram usadas para PCR em tempo real com SYBR® Green, capaz de diferenciar os complexos Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium avium. A análise estatística foi realizada para comparar os resultados de teste de tuberculina, padrão ouro para o diagnóstico in vivo da bTB, com PCR em tempo real, determinando-se assim a especificidade e sensibilidade do método molecular. O teste cervical comparativo (TCC) foi realizado em 238 animais, dos quais 193 tiveram DNA dos suabes nasais adequados para análise molecular, como indicado pela amplificação do gene gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), e foram incluídos no estudo. No total, 25 (10,5%) animais foram reativos no TCC, dos quais nenhum foi positivo no teste molecular. Dos 168 animais negativos no TCC, quatro foram positivos para o complexo M. tuberculosis na PCR em tempo real a partir dos suabes nasais. A comparação destes resultados gerou valores de sensibilidade e especificidade de 0% e 97,6%, respectivamente; além disso, baixos coeficientes de concordância e correlação (-0,029 e -0,049, respectivamente) entre os resultados obtidos com ambos os testes também foram observados. Este estudo mostrou que a PCR em tempo real a partir de suabes nasais não é adequada para o diagnóstico in vivo da tuberculose bovina; portanto, o teste da tuberculina ainda é a melhor opção para este fim.(AU)

Pertussis characterization in the central-west region of São Paulo state, Brazil / Caracterização da coqueluche na região centro-oeste do Estado de São Paulo, Brasil

Pertussis is a highly contagious respiratory disease caused by Bordetella pertussis. This study aimed at characterizing the B. pertussis laboratory positivity and the isolated strains in municipalities of the Central-West Region of São Paulo State, Brazil from 2010 to 2014. A total of 597 nasopharyngeal swabs samples were collected from suspected patients and contacts, and analyzed by in vitro culture and Real-Time PCR (qPCR). Culture-positive B. pertussis strains were characterized by serotyping and pulsed-field gel electrophoresis. Considering culture and/or qPCR, the positivity rate was of 19.6%. Out of 117 samples with B. pertussis, 23 were detected by both methods, 89 by qPCR only and five by culture only. Strains presenting FIM3 (40%), FIM2,3 (32%) and FIM2 (28%) serotypes were found. Five pulsotypes were detected by PFGE, 48% of which identified as BP.Xba.0039, being the predominant type in this study. Among the positive strains, 50% were isolated from <2 months old-children and 17% were isolated from three to six months old patients. Non-vaccinated children or with incomplete vaccination schedule were at the major risk of complications and death, highlighting the importance of a continuous monitoring of this infection for the future control strategies.

A coqueluche é uma doença respiratória altamente contagiosa causada por Bordetella pertussis. Este estudo caracterizou a positividade de B. pertussis e as cepas isoladas em municípios da Região Centro-Oeste do Estado de São Paulo de 2010 a 2014. Foram coletados 597 esfregaços nasofaríngeos de pacientes e contatos suspeitos de coqueluche, e analisados por cultura e Real-TimePCR (qPCR). Os isolados de B. pertussis obtidos de cultura foram caracterizados por sorotipagem e eletroforese em gel de campo pulsado. Considerando-se a cultura e/ou qPCR, verificou-se taxa de positividade de 19,6%. Das 117 amostras positivas para B. pertussis, 23 foram detectadas por ambos os métodos, 89 apenas por qPCR e cinco apenas na cultura. Foram detectadas cepas de sorotipos FIM3 (40%), FIM2,3 (32%) e FIM2 (28%). Cinco pulsotipos foram detectados pela PFGE, e 48% identificados como BP.Xba.0039, o tipo predominante neste estudo. Entre as cepas positivas, 50% foram isoladas de crianças menores de dois meses e 17% isoladas da faixa etária de três a seis meses. Crianças não vacinadas ou com esquema de vacinação incompleta têm maior risco de complicações e óbito, o que ressalta a importância do monitoramento contínuo desta infecção para futuras estratégias de controle.

Expressão dos genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 e EFG1 de Candida albicans em biofilmes após inativação fotodinâmica / Expression of the Candida albicans genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 and EFG1 in biofilms after photodynamic inactivation

Os micro-organismos estão se tornando cada vez mais resistentes aos antimicrobianos e cepas de Candida albicans resistentes aos antifúngicos tem sido isoladas, assim, torna-se importante e necessário a realização de pesquisas que avaliem os efeitos de novos métodos terapêuticos, como a inativação fotodinâmica antimicrobiana (aPDI). Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da inativação fotodinâmica sobre biofilmes de Candida albicans, avaliando seus efeitos sobre a expressão dos genes TEC1 (fator de transcrição), HWP1 (proteína de parede celular das hifas), EFG1 (regulador transcricional relacionado com a morfogênese), BCR1 (regulador da formação de biofilme e da parede celular), CPH1 (regulador transcricional envolvido na morfogênese) e ALS3 (adesina) de C. albicans. Foram avaliadas 30 amostras isoladas de pacientes portadores de HIV e 30 amostras de pacientes com estomatite protética, quanto a produção de biofilme, peso seco e filamentação. Destas, foram selecionadas as amostras mais virulentas de cada grupo que apresentaram melhor capacidade de formação de biofilme e filamentação. Assim, foi utilizada uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente portador de HIV, uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente com estomatite protética e uma cepa padrão ATCC 18804. A quantificação da expressão dos genes foi relacionada à produção desses genes nas amostras clínicas e na cepa de referência utilizando-se ensaio de PCR em tempo real. Para a aPDI, foram utilizados os fotossensibilizadores azul de metileno a 300 µM e eritrosina a 400 µM sensibilizados com laser de Índio-Gálio-Alumínio-Fósforo de baixa potência (vermelho visível, 660 nm) e LED verde (532 ± 10 nm), respectivamente. Foram avaliados quatro grupos experimentais para a aPDI: a) F+L+: sensibilização com o corante e irradiação com luz; b) F+L-: somente tratamento com o fotossensibilizador; c) F-L+: somente irradiação com luz e d) F-L-: sem sensibilização com o corante e ausência de luz. Os resultados foram analisados por t-test, com um nível de significância de 5%. Após a análise fenotípica, as amostras Ca30 e 39 S foram selecionadas para a realização da aPDI. Como esperado, apenas para o grupo F+L+, quando comparado com o grupo F-L-, todos os genes analisados foram sub expressos após a aPDI. O fold-decrease para os genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 e EFG1 foram 0,73; 0,39; 0,77; 0,71; 0,67 e 0,60; para laser, respectivamente, e 0,66; 0,61; 0,50; 0,43; 0,54 e 0,66; para LED, respectivamente. Pode-se concluir que a aPDI mostrou uma redução na expressão dos genes de C. albicans, sugerindo a diminuição de sua virulência(AU)

Os micro-organismos estão se tornando cada vez mais resistentes aos antimicrobianos e cepas de Candida albicans resistentes aos antifúngicos tem sido isoladas, assim, torna-se importante e necessário a realização de pesquisas que avaliem os efeitos de novos métodos terapêuticos, como a inativação fotodinâmica antimicrobiana (aPDI). Assim, o objetivo deste estudo foi verificar os efeitos da inativação fotodinâmica sobre biofilmes de Candida albicans, avaliando seus efeitos sobre a expressão dos genes TEC1 (fator de transcrição), HWP1 (proteína de parede celular das hifas), EFG1 (regulador transcricional relacionado com a morfogênese), BCR1 (regulador da formação de biofilme e da parede celular), CPH1 (regulador transcricional envolvido na morfogênese) e ALS3 (adesina) de C. albicans. Foram avaliadas 30 amostras isoladas de pacientes portadores de HIV e 30 amostras de pacientes com estomatite protética, quanto a produção de biofilme, peso seco e filamentação. Destas, foram selecionadas as amostras mais virulentas de cada grupo que apresentaram melhor capacidade de formação de biofilme e filamentação. Assim, foi utilizada uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente portador de HIV, uma amostra clínica de C. albicans isolada de paciente com estomatite protética e uma cepa padrão ATCC 18804. A quantificação da expressão dos genes foi relacionada à produção desses genes nas amostras clínicas e na cepa de referência utilizando-se ensaio de PCR em tempo real. Para a aPDI, foram utilizados os fotossensibilizadores azul de metileno a 300 µM e eritrosina a 400 µM sensibilizados com laser de Índio-Gálio-Alumínio-Fósforo de baixa potência (vermelho visível, 660 nm) e LED verde (532 ± 10 nm), respectivamente. Foram avaliados quatro grupos experimentais para a aPDI: a) F+L+: sensibilização com o corante e irradiação com luz; b) F+L-: somente tratamento com o fotossensibilizador; c) F-L+: somente irradiação com luz e d) F-L-: sem sensibilização com o corante e ausência de luz. Os resultados foram analisados por t-test, com um nível de significância de 5%. Após a análise fenotípica, as amostras Ca30 e 39 S foram selecionadas para a realização da aPDI. Como esperado, apenas para o grupo F+L+, quando comparado com o grupo F-L-, todos os genes analisados foram sub expressos após a aPDI. O fold-decrease para os genes ALS3, HWP1, BCR1, TEC1, CPH1 e EFG1 foram 0,73; 0,39; 0,77; 0,71; 0,67 e 0,60; para laser, respectivamente, e 0,66; 0,61; 0,50; 0,43; 0,54 e 0,66; para LED, respectivamente. Pode-se concluir que a aPDI mostrou uma redução na expressão dos genes de C. albicans, sugerindo a diminuição de sua virulência(AU)

Optimized broad-range real-time PCR-based method for bacterial screening of platelet concentrates

Abstract Bacterial contamination of blood components remains a major challenge in transfusion medicine, particularly, platelet concentrates (PCs) due to the storage conditions that support bacterial proliferation. In this study, we develop a rapid, sensitive and specific real-time PCR protocol for bacterial screening of PCs. An internally controlled real-time PCR-based method was optimized and validated with our proprietary 16S Universal PCR Master Mix (IBMP/Fiocruz), which targets a conserved region of the bacterial 16S rRNA gene. Nonspecific background DNA was completely eliminated by treating the PCR Master Mix with ethidium monoazide (EMA). A lower limit of detection was observed for 10 genome equivalents with an observed Ct value of 34±1.07 in calibration curve generated with 10-fold serial dilutions of E. coli DNA. The turnaround time for processing, including microbial DNA purification, was approximately 4 hours. The developed method showed a high sensitivity with no non-specific amplification and a lower time-to-detection than traditional microbiological methods, demonstrating it to be an efficient means of screening pre-transfusion PCs.

Resumo A contaminação bacteriana dos componentes sanguíneos é um grande desafio na medicina transfusional, principalmente nos concentrados de plaquetas (PCs) devido às condições de armazenamento que favorecem a proliferação bacteriana. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo de PCR em tempo real rápido, sensível e específico para a triagem bacteriana de PCs. Um método baseado em PCR em tempo real, controlado internamente, foi otimizado e validado com um Master Mix Universal PCR 16S (IBMP / Fiocruz), que detecta uma região conservada do gene 16S rRNA bacteriano. O background de DNA não específico foi completamente eliminado tratando a PCR Master Mix com monoazida de etídio (EMA). O limite de detecção inferior observado foi de 10 cópias equivalentes do genoma com um valor de Ct 34 ± 1,07, a curva de calibração foi gerada com diluições seriada de 10 vezes do DNA de E. coli. O tempo de processamento, incluindo a purificação microbiana do DNA, foi de aproximadamente 4 horas. O método desenvolvido mostrou alta sensibilidade sem amplificação inespecífica e menor tempo de detecção do que os métodos microbiológicos tradicionais, demonstrando ser um meio eficiente de triagem de PCs pré-transfusionais.